洛普替尼(Repotrectinib、TPX-0005、瑞波替尼)说明书中有效减少 ALK 驱动的神经母细胞瘤细胞的生长

抽象的

神经母细胞瘤是出生后第一年最常被诊断出的颅外肿瘤。大约 9% 的神经母细胞瘤患者在编码间变性淋巴瘤激酶 (ALK) 的基因中出现种系或体细胞畸变。这增加了高危神经母细胞瘤，其中ALK 的频率为 14%在诊断时出现畸变，并在复发时显示出增加的数量。用激酶抑制剂消除 ALK 活性被用作恶性肿瘤(如非小细胞肺癌)的临床治疗，并在小儿炎性肌纤维母细胞肿瘤和间变性大细胞淋巴瘤中显示出良好的效果。第一代 ALK 抑制剂克唑替尼在神经母细胞瘤患者中的 I 期临床试验显示出适度的结果，并表明需要进一步研究。ALK 抑制剂的不断发展催生了第三代抑制剂 repotrectinib (TPX-0005)，它针对 ALK、ROS1 和 TRK 受体的活性激酶构象。在本研究中，我们在体外和体内研究了 repotrectinib 在神经母细胞瘤环境中的作用. 神经母细胞瘤细胞系用 repotrectinib 处理以研究 ALK 的抑制作用并确定其对增殖的影响。用不同 ALK 突变变体转染的 PC12 细胞用于研究 repotrectinib 阻断 ALK 激活/信号传导的功效。在体内也分析在神经母细胞瘤异种移植模型中的repotrectinib效果。我们的结果表明，repotrectinib 能够抑制在神经母细胞瘤患者中发现的一系列 ALK 突变变体的信号活性，重要的是它在神经母细胞瘤的异种移植模型中表现出强大的抗肿瘤作用。

介绍

神经母细胞瘤是交感神经系统的胚胎性肿瘤，约占所有儿科癌症死亡人数的 15% 1 , 2 , 3。原发肿瘤起源于交感神经系统，通常位于肾上腺1 , 2 , 3附近。. 尽管很难预测神经母细胞瘤患者的预后，但国际神经母细胞瘤风险小组 (INRG) 工作组已经建立了一个分层系统。神经母细胞瘤患者根据不同的预后因素分为低危、中危和高危疾病，即诊断时的年龄、临床分期、肿瘤组织学和肿瘤分化、染色体 11q 状态、MYCN 扩增和 DNA 倍性4 , 5。大约 50% 的新诊断患者被归类为高危神经母细胞瘤，这些患者的 5 年生存率为 40-50% 2 , 6 , 7。

在改变ALK基因在这两个家族性和散发神经母细胞瘤的情况下被发现，并且在复发患者人群更高的频率6，8，9。ALK是由ALKAL激活的受体酪氨酸激酶(RTK)配体10，11，12，13，14，15，16。在脊椎动物中，ALK 在中枢和外周神经系统中表达12 , 14 , 17. 在小鼠ALK是，虽然行为表型和激素紊乱已经在敲除小鼠报道过严格的开发过程中所需的18，19，20，21。尽管已鉴定出许多ALK突变，但 ALK 激酶结构域中残基 F1174、F1245 和 R1275 的三个“热点”是神经母细胞瘤患者 ALK 畸变的主要原因6。这些突变促进ALK活化导致组成下游信号22，23。

已开发出多种 ALK 抑制剂，如克唑替尼、色瑞替尼、艾乐替尼和布加替尼，并在临床上用于治疗 ALK 融合阳性肿瘤患者，如 EML4-ALK 阳性非小细胞肺癌 (NSCLC) 24 , 25 . 在 ALK 阳性儿科癌症中的初始克唑替尼临床试验显示，在炎性肌纤维母细胞瘤 (IMT) 和间变性大细胞淋巴瘤 (ALCL) 中携带 ALK 融合的患者具有很强的抗肿瘤活性，但在表达全长 ALK 26. 最近提交的一项后续研究报告了克唑替尼治疗在患有 ALCL 和 IMT 的儿科患者中的稳健和持续的临床反应，强调了在这些疾病中取消 ALK 激酶活性的重要性27。在成人人群中，尽管 ALK 抑制剂最初具有抗肿瘤作用，但耐药性通常以 ALK 激酶结构域突变或旁路机制的形式出现，限制了临床疗效28 , 29，并强调了开发新的ALK 抑制方案能够更好地克服复发性 ALK 阳性肿瘤生长。

最近开发了一种新的 ALK 抑制剂 repotrectinib 30。该化合物具有一个紧凑的三维大环结构，允许其不同激酶，包括ALK，ROS1和泛TRK的ATP结合口袋内结合，以避免从所述激酶溶剂前的残基的突变位阻30，31。repotrectinib 对 ATP 腺嘌呤结合位点的高亲和力使其能够阻断野生型和各种突变型 ALK 活性。研究表明，repotrectinib 可有效抑制 ALK 以及相关的 RTK、ROS1 和 TRKA-C 32. Repotrectinib 目前正在一项 1/2 期多中心、首次人体研究中进行研究，以定义携带 ALK、ROS1 或 NTRK1-3 重排的晚期实体瘤患者的安全性、耐受性、药代动力学和抗肿瘤活性。 TRIDENT-1，clinicaltrials.com)。初步结果表明，repotrectinib 耐受性良好，表现出颅内和颅外临床活性，患者表现出部分反应，包括那些肿瘤具有阳性溶剂前沿 ROS1 或 TRK 突变的患者32. 基于这种抑制剂在 ATP 结合袋中的不寻常结合特性，我们决定在神经母细胞瘤环境中全长 ALK 的背景下探索 repotrectinib 的治疗潜力，其中功能获得性突变主要发生在 α-C-螺旋和激活环。

结果

Repotrectinib 抑制 ALK 成瘾性神经母细胞瘤细胞的增殖

的ALK抑制剂repotrectinib已经在非小细胞肺癌的临床前模型中已经研究，其结果表明针对与ALK活性增加细胞中的抗肿瘤效果30，31，32，33。为了确定 repotrectinib 在神经母细胞瘤环境中是否具有抗癌活性，我们决定使用两组神经母细胞瘤细胞系研究其对细胞增殖的影响。第一组是ALK-嗜神经母细胞瘤细胞系：(ⅰ)CLB-BAR，窝藏放大的ALK基因座具有缺失外显子4至11个(Δ4-11)ALK导致的胞外域ALK缺失，(ⅱ)凯利，其中包含ALK-F1174L突变和 (iii) CLB-GE，它包含一个ALK-F1174V突变，位于激酶结构域的 α-C-螺旋中。所述第二组的神经母细胞瘤细胞系包括SK-N-AS和SK-N-BE，其是无反应ALK抑制剂，34，35。用浓度增加的 repotrectinib 或克唑替尼处理细胞。在用 repotrectinib 处理后，增殖率降低(图 1，表 1)，并且在 ALK 成瘾细胞中效果更明显(与 ALK 非成瘾细胞相比，IC 50降低近两倍)(图 1a) . CLB-BAR、CLB-GE 和 Kelly 电池具有 IC 50分别为 124.1 ± 4.89、259.4 ± 6.3 和 310.9 ± 7.9 nM，而 SK-N-AS 和 SK-N-BE 电池的 IC 50值更高，分别为 594.8 ± 47.3 nM 和 510.8 ± 16.94 nM(分别为表 1) . 用作为阳性对照的克唑替尼治疗也降低了先前报道的 ALK 成瘾性神经母细胞瘤细胞的细胞增殖(图 1b和表 1)。用 ALK TKI 处理的 CLB-BAR 和 CLB-GE 细胞裂解物的免疫印迹分析证实，repotrectinib 降低了 pY1604-ALK、pERK5、pSTAT3、p-p70 S6K、pAKT 和 pERK 水平(图 1c)。因此，repotrectinib 和克唑替尼都抑制 ALK 成瘾细胞系的增殖，并抑制 ALK 下游信号靶标的磷酸化。

Repotrectinib 抑制神经母细胞瘤细胞的增殖。神经母细胞瘤细胞用 repotrectinib 或克唑替尼处理五天，并通过活细胞成像监测细胞融合。(a) Repotrectinib 反应曲线和(b )克唑替尼反应曲线。绘制的值是来自一式三份进行的三个独立实验的生长曲线的平均值±SD。(C)CLB-BAR 和 CLB-GE 都是 ALK 成瘾细胞系，用 200 或 300 nM reptorectinib 处理。克唑替尼(200 nM 和 300 nM)用作阳性对照。在 SDS/PAGE 上解析细胞裂解物，然后对 pALK (Y1604)、pAKT (S473)、pERK 1/2(T202/Y204)、pERK5 (T218/Y220)、p70 S6 激酶 (T389) 和 pSTAT3 (Y705) 进行免疫印迹. ALK、AKT、ERK 1/2、ERK5、S6 激酶和 STAT3 的总蛋白质用作蛋白质加载对照。在对总蛋白质进行剥离和免疫印迹之前，使磷酸化蛋白质可视化。CLB-BAR 细胞在外显子 4-11 之间的ALK 中存在基因组缺失，导致 ALK 条带约为 170 kDa 54. CLB-GE 细胞系表达 ALK-F1174V 的突变全长版本，该版本被切割，导致使用此处使用的抗体检测到两个条带。印迹代表三个独立的实验。